La Recombinación homóloga (RH)

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En el mecanismo de RH, uno de los mecanismos principales para reparar las lesiones de doble cadena. RH  requiere una cromátida hermana u homóloga para la reparación. Delimitando la predilección de este mecanismo en las fases del ciclo celular S (Síntesis) y G2 (Gap 2), cuando una plantilla hermana está disponible debido a la replicación del ADN. Brevemente, esta vía de reparación es iniciada por el complejo MRN, que une los extremos rotos del ADN para reclutar y activar la quinasa ATM. Una vez activada, ATM activa la actividad nucleolítica de la proteína que interactúa con CTBP (CtIP) y MRE11. Junto con otras nucleasas como EXO1 y DNA2, se generarán proyecciones de ADN monocatenario (ss) 3 ', cuya degradación se impide mediante la unión de la proteína RPA.

Hay tres fases conceptuales principales en la reparación por secuencias homologas (ver Figura): presináptica, sináptica y postsináptica. En la fase presináptica, se lleva a cabo la resección (corte) de los extremos del ADN, un mecanismo en el que las enzimas nucleolíticas procesan los extremos de las lesiones de doble cadena (DSBs) generando largos tramos de ADN monocatenario (ssDNA). La resección se inicia mediante la acción de las proteínas MRE11 y CtIP, posteriormente, el ssDNA se recubre con RPA. En un paso adicional, tanto BRCA2 como RAD54 estimulan el cambio de RPA a RAD51, lo que permite la formación del nucleofilamento RAD51. En la fase de sinapsis, el nucleofilamento RAD51 sirve de intermediario en la búsqueda de la secuencia homologa y la formación de un bucle D (D-loop). En la última fase, la fase postsináptica, se espera que RAD51 se disocie de los extremos de ADN para permitir pasos adicionales como la síntesis de ADN (Bakr et al., 2015).

-          La Fase presináptica: resección de los extremos de lesiones de doble cadena

La reparación por recombinación homóloga requiere la producción de protuberancias de ADN monocatenario 3 '. Esto ocurre a través de la resección de los extremos 5’ de las lesiones DSB principalmente por el complejo MRN y CtIP, y puede tener lugar una resección más extensa por la acción de EXO1, DNA2 y / o BLM, para saber más:  Cejka 2015.

La actividad exonucleasa de MRE11 es crucial en el inicio de la resección y requiere estimulación CtIP. La resección de extremimades de DSBs y la generación de protuberancias de ADN monocatenarias 3' son favorecidas por la proteína BRCA1 (una sección de este blog será dedicada a esta proteína). Por otro lado, las actividades helicasa de DNA2 y BLM / WRN son encargadas de promover una resección extensa. Es de destacar que recientemente se demostró que CtIP también estimula la actividad de la helicasa BLM y regula al alza la actividad endonucleasa de DNA2, mejorando así la resección de largo alcance en una manera independiente de MRN (Daley et al., 2017).

-          Fase de sinapsis: ensamblaje de filamentos RAD51, invasión de cadenas

Una vez que se completa la resección, la recombinación homóloga continúa con la formación de un filamento de la nucleoproteína RAD51 cuyo rol principal en esta parte del proceso es ayudar a la invasión de la cromátida hermana homóloga. El intercambio entre RPA unido al ssDNA por RAD51 necesita la proteína BRCA2. De hecho, el reclutamiento de la proteína BRCA2 lo realiza BRCA1 a través de PALB2; una proteína que interactúa con BRCA1 y BRCA2. Sucesivamente, el reemplazo de RPA por RAD51 en uno de los extremos resecados está mediado por BRCA2 (Holloman, 2011). El emparejamiento homólogo facilitado por RAD54 (Mazin, 2009).

La estructura heterodúplex resultante está acoplada a la formación de una estructura de bucle de desplazamiento (bucle D o D-loop en inglés) y una unión de Holliday. El extremo 3 'de la cadena invasora inicia la síntesis de reparación utilizando como plantilla la secuencia homóloga. Recientemente, un estudio propuso que RN168 está involucrado en la recombinación homóloga en un fondo genético donde la proteína BRCA1 es deficiente (Zong et al., 2019).

-           Fase postsináptica, resolución (modelos de reparación dirigida por homología: (dHJ, SSA, SDSA, BIR)

La reparación de las DSB mediante la reparación dirigida por homología se puede realizar mediante cuatro subvías después de la resección. El primero, hibridación de cadena dependiente de síntesis (SDSA), un mecanismo que conduce a la conversión de genes (GC), e iniciado por la invasión del extremo 3 'ssDNA en una plantilla homóloga que forma un bucle de desplazamiento (bucle D). La segunda vía secundaria, la doble unión de Holliday (dHJ), que también es un mecanismo de conversión de genes que copia un pequeño parche de ADN, dHJ requiere la invasión de la hebra seguida de la estabilización de un bucle D.

La tercera vía secundaria, la replicación inducida por ruptura (BIR) es un mecanismo de RH único que se emplea en situaciones en las que un solo extremo del DSB actúa de forma independiente; esto podría suceder cuando un lado de la ruptura no puede interactuar con una secuencia homóloga, o cuando los dos extremos encuentran diferentes plantillas homólogas (para saber más: Malkova, 2018. BIR implica la síntesis conservadora de ADN a través de un mecanismo de "burbuja migratoria", que genera tractos de ssDNA que son vulnerables a mutación. Como resultado, BIR es un mecanismo altamente mutagénico.

Finalmente, la vía secundaria hibridación monocatenaria (Singlee strand annealing en inglés -SSA) puede tener lugar entre secuencias homólogas, independientemente de la invasión de la hebra homologa y, por lo tanto, de RAD51, la resección 5'-3 'continúa hasta exponer secuencias complementarias flanqueantes y poder hibridar entre sí. El apareamiento de estas secuencias es facilitado por la proteína RAD52. Para saber más:  Kowalczykowski 2015

 

Referencias

Bakr, A., C. Oing, S. Köcher, K. Borgmann, I. Dornreiter, C. Petersen, E. Dikomey, and W. Y. Mansour. 2015. “Involvement of ATM in Homologous Recombination after End Resection and RAD51 Nucleofilament Formation.” Nucleic Acids Research 43 (6): 3154–66. https://doi.org/10.1093/nar/gkv160.

Cejka, Petr. 2015. “DNA End Resection: Nucleases Team up with the Right Partners to Initiate Homologous Recombination.” Journal of Biological Chemistry 290 (38): 22931–38. https://doi.org/10.1074/jbc.R115.675942.

Daley, James M., Judit Jimenez-Sainz, Weibin Wang, Adam S. Miller, Xiaoyu Xue, Kevin A. Nguyen, Ryan B. Jensen, and Patrick Sung. 2017. “Enhancement of BLM-DNA2-Mediated Long-Range DNA End Resection by CtIP.” Cell Reports 21 (2): 324–32. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.09.048.

Holloman, William K. 2011. “Unraveling the Mechanism of BRCA2 in Homologous Recombination.” Nature Structural and Molecular Biology 18 (7): 748–54. https://doi.org/10.1038/nsmb.2096.

 Kowalczykowski, Stephen C. 2015. “An Overview of the Molecular Mechanismsof Recombinational DNA Repair.” Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 7 (11): 1–36. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a016410.

Malkova, A. 2018. “Break-Induced Replication: The Where, The Why, and The How.” Trends in Genetics 34 (7): 518–31. https://doi.org/10.1016/j.tig.2018.04.002.

Mazin. 2009. “Rad54, the Motor of Homologous Recombination” 11 (3): 127–34. https://doi.org/10.1016/j.dnarep.2009.12.006.Rad54.

Zong, Michael J. Kruhlak, Elsa Callén, Nancy Wong, Neil Johnson, Yifan Wang, Daniel Durocher, et al. 2019. “BRCA1 Haploinsufficiency Is Masked by RNF168-Mediated Chromatin Ubiquitylation.” Molecular Cell, 1267–81. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.12.010.